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微生物分离纯化及鉴定技术

作者:中国贝博网页版来源:贝博网页版厂家 日期:2021-06-10 09:24

微生物分离纯化及鉴定

 
微生物鉴定是指借助现有的分类系统,通过对未知微生物的特征测定,对其进行细菌、酵母菌和霉菌大类的区分,或属、种及菌株水平确定的过程,它是药品微生物检验中的重要环节.
 
非无菌产品的微生物检查:对选择贝博网页版或指示贝博网页版上发现的疑似菌落需进行鉴定;
控制菌检查(通则1106)
 
无菌检查法(通则1101)
对阳性实验结果中分离的微生物进行鉴定,以判定试验是否重试;
 
药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则(通则9203),对洁净室和其他受控环境分离到的微生物进行鉴定,以掌握环境微生物污染情况,有助于污染调查;
 
其他
对药物原料、辅料、制药用水、生产环境、中间产物和终产品中检出的微生物进行适当水平的鉴定.
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微生物鉴定需达到的水平视情况而定,包括属、种鉴定和菌株分型
常规特征分析(属水平鉴定)
大多数非无菌药品生产过程和部分无菌生产环境的风险评估中,对所检出微生物的常规特征包括菌落形态学、细胞形态学、革兰染色或其它染色法、及某些能够给出鉴定结论的关键生化反应进行分析.
种水平鉴定
非无菌药品产品的控制菌检查应达到种的水平
菌株分型
无菌试验结果阳性和无菌生产模拟工艺失败时,对检出的微生物鉴定一般需达到菌株水平.
 
微生物鉴定程序
微生物鉴定程序图
 
分离纯化技术
获得纯培养物对微生物学研究至关重要,平板划线法是分离纯化常用技术.
纯培养物是指来源于同一单细胞的细胞群体
分离纯化技术图片
在划线过程中,细胞逐渐分散,培养后可形成单个菌落.
成功获得纯培养物依赖于样品中混合在一起的细胞是否有效的被相互分开.
 

1、20201

初筛实验
初筛实验图片
 
可能导致染色结果不理想的原因:
老龄培养物可能导致革兰氏染色不确定,选用新鲜培养的细菌;
过度加热固着可能使革兰氏阳性菌变为革兰氏阴性菌;
脱色剂使用过多会出现假阴性,使用太少有可能出现假阳性.

2、芽胞染色21210

细菌能否形成芽胞以及芽胞的形状、芽胞在芽胞囊内的位置、芽胞囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一.
芽胞染色图片
芽胞染色图2
 
20210芽孢染色液
规格:10ml×4支/盒;包装内容:孔雀绿染色液3支、番红染色液1支
 
由于芽孢在结构和化学成分上均有别于营养细胞,所以芽孢也就具有了许多不同于营养细胞的特性.芽孢是整个生物界中抗逆性最强的生命体,对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性.
例如,肉毒梭菌的芽胞在沸水中要经过5至9.5h才被杀死;巨大芽胞杆菌芽胞的抗辐射能力比E.coli细胞要强36倍.芽胞的休眠能力更为突出,在常规条件下,一般可以保持几年至几十年而不死.据文献记载,有的芽胞甚至可以休眠数百至数千年,最极端的例子是在美国的一块有2500万~4000万年历史的琥珀,至今从其中蜜蜂肠道内还可以分离到有生命的芽胞.
是否能消灭芽孢是衡量各种消毒灭菌手段的最重要的指标.【50203枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢菌片:用于环氧乙烷灭菌效果检测;50204嗜热脂肪杆菌芽孢菌片:用于压力蒸汽灭菌效果检测】芽孢是细菌的休眠体,在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞;产芽孢细菌的保藏多用其芽孢.(如何获得芽孢?)产芽孢的细菌多为杆菌,也有一些球菌.芽孢的有无、形态、大小和着生位置是细菌分类和鉴定中的重要指标.芽孢与营养细胞相比化学组成存在较大差异,容易在光学显微镜下观察.
50203枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢菌片使用方法:
使用时将装有菌片的小纸袋放在被灭菌的物品中心部位(每锅放置菌片数按卫生部规定或其它相关标准规定).
灭菌后,无菌操作取出小纸袋中的菌片,投放到营养肉汤(产品编号10204,按使用说明配制,分装试管,5ml/支,灭菌后4℃保存备用)中.同时将两片未经灭菌的菌片分别投入两管营养肉汤中作对照.
37℃培养7天,观察结果,对照管呈混浊:若灭菌后营养肉汤澄清透明,则为阴性,表示灭菌彻底;若灭菌后营养肉汤浑浊,则为阳性,表示灭菌不彻底.
当出现阳性结果时,为确定是否为灭菌后接种操作过程中操作不当污染所致,可使用无菌操作取0.2ml营养肉汤涂布接种至营养ballbet贝博网页版(产品编号10103)平板上,置37℃培养48小时,涂片镜检或作进一步试验.
枯草芽孢杆菌为G+杆菌,极易形成芽孢,芽孢位置位于菌体中央,不膨大.芽孢染色为孔雀绿着色.在营养ballbet贝博网页版上菌落呈棕色并随时间延长菌落逐渐着上黑色.
50204嗜热脂肪杆菌芽孢菌片:
使用时将装有菌片的小纸袋放在被灭菌的物品中心部位(每锅放置菌片数按卫生部规定或其它相关标准规定),视需要也可将小纸袋盛于试管等特定容器中再进行灭菌
灭菌后,无菌操作取出小纸袋中的菌片,投放到溴甲酚紫蛋白胨培养液(产品编号10114,按使用说明配制,分装试管,5ml/支,灭菌后4℃保存备用.)中.同时将未经灭菌的菌片投入另一管培养液中作对照.
56℃±1℃培养48小时,观察结果,对照管呈黄色:若灭菌后菌片培养液呈紫色,则阴性,表示灭菌彻底;若灭菌后菌片培养液呈黄色,则为阳性,表示灭菌不彻底.
嗜热脂肪芽孢杆菌为G+杆菌,芽孢染色为孔雀绿着色.
 

3、其他染色技术

抗酸染色;鞭毛染色;内含物-异染粒染色
其它染色技术图
 

4、需氧类型

接种:用1小环(外径1.5毫米的接种环)的肉汤菌液,穿刺接种到贝博网页版中,穿刺到管底.30℃培养,分别在3至7天观察结果.
结果观察:如细菌在ballbet贝博网页版柱表面上生长者为好氧菌,如沿着穿刺线上生长者为厌氧菌或兼性厌氧菌.
需氧类型图片
 

5、生化筛选实验

1)氧化酶试验:(20202)
用于区分不发酵的革兰氏阴性杆菌(氧化酶阳性)和肠道菌(氧化酶阴性)
原理:氧化酶亦即细胞色素氧化酶,为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶,氧化酶先使细胞色素C氧化,然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化,产生颜色反应.
操作:暗室中,使用无菌镊子取出一张纸片,滴加1滴无菌生理盐水浸湿,挑取新鲜的待
检菌苔涂抹于纸片上,1分钟内纸片变紫则为阳性.试验副溶血性弧菌为阳性,大肠埃希氏菌为阴性

生化筛选实验

 
应用:肠杆菌科氧化酶阴性,非发酵菌氧化酶阳性(个别除外),弧菌科,奈瑟菌属、莫拉菌属阳性.
注:本品见光易变质,请于暗室保存,使用时避免遇强光;待检菌苔必须是新鲜的,且无杂菌,否则极易造成误判
 
2)过氧化氢酶试验(20706)
原理:具有过氧化氢酶的细菌,能催化过氧化氢生成水和原子态氧,继而形成分子氧,出现气泡.
操作:接种环挑取培养24h菌种一环,涂抹于滴有3%H2O2的玻片上.
过氧化氢酶试验图片
应用:革兰氏阳性球菌中,葡萄球菌和微球菌均产生过氧化氢酶,而链球菌属为阴性,故此试验常用于革兰阳性球菌的初步分群.
3)凝固酶试验
凝固酶:致病性葡萄球菌大多能产生凝固酶,非致病葡萄球菌不产生此酶.凝固酶分为结合型和游离型两种.
结合型凝固酶:结合在细胞壁,与纤维蛋白原结合,使纤维蛋白原变为纤维蛋白,引起细菌凝集,采用玻片法检测;
游离型凝固酶:分泌至细菌体外,被血浆中凝固酶反应因子激活,形成葡萄球菌凝血酶,使纤维蛋白原变为纤维蛋白,导致血浆凝固,采用试管法检测.
操作:
玻片法——取洁净玻片一张,滴加兔血浆(20802)一滴;用接种环取实验菌苔一环,在兔血浆中研磨混匀;结果观察:如出现颗粒状凝集现象即为血浆凝固酶实验阳性.如不立即发生凝集,可轻摇玻片加速反应,若仍无凝集则为阴性.
3)凝固酶试验图片
 
试管法——取肉汤培养物0.5ml同0.5ml兔血浆于试管内充分混合,置36±1℃培养;定时观察是否有凝块形成,至少观察6h,以内容物完全凝固,使试管倒置或倾斜时不流动者为阳性.
阳性对照:金黄色葡萄球菌兔血浆&冻干兔血浆
4)碳水化合物氧化和发酵
不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异,或能利用或不能利用,能利用者,或产气或不产气.可用指示剂及发酵管检验.
实验方法:
以无菌操作,用接种针或环移取纯培养物少许,接种于发酵液体贝博网页版管,若为半固体贝博网页版,则用接种针作穿刺接种.
接种后,置36±1℃培养,每天观察结果,检视贝博网页版颜色有无改变(产酸),小倒管中有无气泡,微小气泡亦为产气阳性,若为半固体贝博网页版,则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡,有时还可看出接种菌有无动力,若有动力、培养物可呈弥散生长.
4)碳水化合物氧化和发酵图片
 
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